HPV相关宫颈癌生物治疗的研究进展
国外医学妇产科学分册1999年第26卷第4期
湖北三峡学院医学院生物化学教研室（443003） 盛德乔 综述
湖北医科大学病毒所分子生物室 伍欣星 审校
摘 要 高危型HPV感染与人类一些恶性肿瘤的发生密切相关。HPV16,18的感染是宫颈癌发生的一个主要致病因子，本文就肿瘤特异性抗原疫苗，基因修饰的肿瘤特异性疫苗，肿瘤肽疫苗及反义技术在HPV相关宫颈癌生物治疗方面取得的进展作一综述。
关键词 宫颈癌 生物治疗
人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）的基因组分为三个区：早期区（E区）、晚期区（L区）和上游调节区（URR）。E区含有5-8个开放阅读框（ORFs）。HPV16，18 e6/E7已被证实是转化基因，其编码的E6，E7蛋白在宫颈癌细胞系和癌组织细胞内持续表达，并在维持转化组织恶性表型的过程中起着至关重要的作用。HPV感染与泌尿生殖系统的上皮恶性肿瘤及食道癌、口腔粘膜癌等多种瘤的发生有关，其中90%以上恶性肿瘤为HPV16，18感染，最明显的是宫颈癌。近年来，随着分子生物学、分子免疫学及基因转移技术的快速发展，以及对抗原识别、提呈、T淋巴细胞活化分子要研究的日益深入，宫颈癌生物治疗的研究已取得了一些令人振奋的成就。
肿瘤的生物治疗包括肿瘤的免疫治疗和基因治疗。早60年代就已发现肿瘤具有免疫原性。致癌病毒引起细胞转化的过程中需表达某些病毒特异性蛋白，这些蛋白也表达于病毒诱发的不同组织来源的肿瘤细胞。因此，致瘤病毒引起的肿瘤往往具有共同的肿瘤特异性移植抗原（tumor specific transplantation antigen,TSTA）,这是提出肿瘤免疫治疗设想的基础。细胞免疫在抗肿瘤免疫中起着非常重要的作用，尤其是细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic t lymphocytes,CTL）诱发的抗肿瘤免疫。宫颈癌的免疫治疗关键的一点就在于诱发有效的HPV特异的CTL。而以反义技术为主的基因治疗则主要是阻断宫颈癌细胞中HPV e6/E7基因的表达，从而逆转其恶性表型。研究表明HPV16，18的E6/E7基因将成为宫颈癌生物治疗的合适目标。
肿瘤特异性抗原疫苗
Chen等首先用实验证实HPV16 E6/E7都是肿瘤特异性移植抗原。用HPV16 e6/E7基因免疫动物可获得HPV16 E6/E7特异的肿瘤排斥反应，此排斥反应由CD8+淋巴细胞介导。Meneguzzi[2]的实验证明了这一点，但实验结果显示，只有部分实验动物诱发了这种保护反应。
1996年Borysiewiz等[3]将表达有HPV16，18的E6和E7的重组痘苗病毒在晚期宫颈癌病人身上进行免疫治疗。在8例病人中，有3例出现了由免疫获得的HPV特异的抗体反应，其中1例还检测到了HPV特异的CTL，这才是最有治疗价值的，而且2例存活的病人肿瘤均已消失。这是人类第一次用重组的痘苗病毒作为治疗性疫苗来治疗宫颈癌。尽管这还只是个小样本病例实验，难以得到可靠的结论，但无疑它给宫颈癌病人的生物治疗带来了曙光。这说明用肿瘤特异性抗原来开发治疗性疫苗是可行的，有很好的发展前景。但是其安全问题却不得不考虑，因为HPV16，18E6/E7蛋白是转化蛋白，为此,Boursnell[4]在实验中运用定点突变技术将E6/E7基因中具有转化活性的个别核苷酸突变，以降低其转化活性。
基因修饰的肿瘤特异性疫苗
肿瘤抗原的丢失或低表达：肿瘤细胞主要组织相容性抗原复合体（MHC）表达的改变，特别是MHC-Ⅰ类抗原表达丢失：T细胞活化所需的共刺激因子B7的缺乏；以及细胞因子异常等是肿瘤逃避机体免疫监视的重要机制，所以，肿瘤的免疫治疗除了开发抗原特异的治疗性疫苗外，还可将外源基因导入肿瘤细胞，改变其遗传背景，提高其免疫原性，开发出基因修饰的肿瘤特异性疫苗。现在已经清楚，肿瘤的特异性抗原必须在宿主体内经过处理后与MHC-Ⅰ类分子结合才能被提呈到细胞表面以激活CD8+T淋巴细胞。有证据表明宫颈癌组织中含有HPV16 E6/E7基因，但缺乏能够提呈E6/E7基因编码抗原特定的MHC-Ⅰ类分子的特定序列TAT-Ⅰ分子[5]，使得HPV16 e6/E7蛋白在宿主体内不被提呈而逃脱了宿主的免疫监视。在表达水平低下或未检测到MHC-Ⅰ类分子的肿瘤细胞中，通过转入适当的MHC基因可增加瘤细胞的免疫原性，诱发特异性的CTL反应，从而杀死瘤细胞，达到治疗的目的。已经有用HLA基因注射而使黑色素瘤患者肿瘤消退，且远处转移结节完全消失的报道。说明这种方法确实具有潜在的价值，但未见用于宫颈癌治疗的报道。
另一研究较多的是共刺激信号B7分子。在动物实验中注入B8基因修饰的肿瘤细胞后，肿瘤细胞的免疫原性增强，抑制肿瘤生长，并产生对原肿瘤细胞排斥的免疫记忆。Chen等[6]将HPV17 e7基因和B7-1基因同时转染小鼠黑色素瘤细胞株，观察其接种小鼠后的致瘤性，结果发现，肿瘤排斥反应同时需要B7和E7两个信号，缺一不可。进一步研究还发现，B7因子在诱导免疫反应的过程中起着很重要的作用，将肿瘤抗原和B7-起提呈给免疫系统可诱发更强烈的CTL反应。美国NIH已批准将B7基因转染的肿瘤细胞制备的新型疫苗试用于临床。B7分子在抗肿瘤免疫所起的作用已被很多实验所证实，现已成为肿瘤免疫治疗的一个热点。
肿瘤肽疫苗
肿瘤抗原诱导细胞毒性T淋巴细胞的第一步是抗原在胞浆内被降解成短肽，与MHC-Ⅰ类分子结合后被提呈于细胞表面为CD8+淋巴细胞所识别。所以，CD8+ t淋巴细胞识别的不是靶细胞表达完整的抗原分子，而是与MHC-Ⅰ类分子结合后递呈到细胞表面的抗原肽。这种抗原提呈和免疫识别理论为肿瘤肽疫苗用作肿瘤免疫治疗提供了理论依据。
细胞毒性T淋巴细胞（CTL）肽表位可用来免疫小鼠以抵御致死性病毒的感染。Feltkamp等[7]首先实验证实HPV16 e7 49-57肽就是这种肽表位。用人工合成的该多肽免疫小鼠抵御E7转化的肿瘤细胞的攻击，阻止肿瘤形成，而且能诱导出一种能体外裂解肿瘤细胞的CTL。Sadovnikova[8]则从另一个HVP16 e7感染的细胞株中分离到了E7 49-57肽，这说明HPV16感染细胞后能表达病毒相关蛋白，并将有效的抗原肽提呈于细胞表面。
随后又有很多人以小鼠为模型鉴定出了几个HPV16 E6，E7的T细胞和B细胞表位[9，10]。为了获得人类本身更直接的证据，Kadish从宫颈癌病人身上鉴定出了几个人类的HPV16 e6/E7的反应性T细胞表位[11]。最近他通过49例患CIN妇女外周血单核细胞对部分HPV16 e6和E7肽反应性T细胞表位的淋巴细胞增殖反应的研究发现：E6/E7多肽的淋巴增殖反应呈阳性的妇女比那些没有反应的更有可能是HPV阴性；在一次临床检查中对E6/E7多肽淋巴增殖反应呈阳性的受试者在下次检查中出现HPV阴性的可能性是那些无反应受试者的4.2倍[2]。这表明HPV16 e6/E7引发的细胞介导的免疫反应与HPV感染的清除和CIN的消退有关，同时也说明用E6/E7蛋白来作为宫颈癌免疫治疗的靶子是有效的。但肿瘤肽疫苗本身有一个缺点就是其免疫原性太弱，要使肿瘤肽疫苗在人体诱导有效的免疫应答必须从提高其免疫原性（包括使用佐剂）及选择有效的免疫方式两方面加以改进。
反义技术
反义技术主要包括反义DNA，反义RNA和核酶（ribozyme）三大技术，其作用机制是抑制转录或转录后加工，或抑制翻译，其目的就是特异性阻断癌蛋白的合成，从而发挥其抑制作用。如果用反义技术能阻断HPV相关宫颈癌细胞中E6/E7蛋白的表达，则可逆转宫颈癌的恶性表型，从而达到治疗目的。Hamada[3]通过腺病毒介导将HPV16 e6/E7反义RNA导入宫颈癌细胞系SiHa后发现，它可抑制HPV16 E6/E7 mRNA的表达及肿瘤生长。事实上，HPV16 E6/E7的反义寡核苷酸已被很多学者证实可抑制HPV阳性细胞的生长，以及这些细胞在裸鼠身上形成的肿瘤[14，15]。反义寡核苷酸可调节细胞的增殖，这引起了某些学者的注意，有人将HPV18 e6/E7反义cDNA转染宫颈癌细胞（HeLa细胞），结果发现HPV18 E6/E7反义cDNA可降低HeLa细胞中表皮生长因子受体（EGF-R）的水平[16]。正常细胞中EGF-R水平很低，而EGF-R在宫颈癌的恶性转化中起着很重要的作用，因此弄清楚反义E6/E7寡核苷酸的作用机制将有助于反义技术更快地应用到临床治疗中去。在美国18-21核苷酸的反义制剂用于治疗HPV感染相关疾病已进入Ⅱ期临床。
核酸用于恶性肿瘤的基因治疗较反义核酸更有优势，因为这具有较稳定的空间结构，不易受到酶的破坏，而且核酶还可对靶序列进行重复切割，具有很高的效率。抗HPV16 e6/E7的锤头状核酶（hammerhead ribozyme）已被证实可在某种程度上抑制体外培养的肿瘤细胞的生长。另一种发夹状核酶（hairpin ribozyme）则被认为是极具潜力的抗病毒制剂。设计合成的抗HPV16的发夹状核酶在体外试验中具有很高的催化裂解靶mRNA的效率；在培养细胞中它可有效地催化降解HPV16 e6靶序列，从而抑制HPV16 E6/E7基因的表达及转化活性[17]。这预示着发夹状核酶在肿瘤基因治疗及抗感染方面将会大有用途。核酶用于基因治疗面临两个问题必须解决，一是核酶基因导入细胞内能否高效表达；二是核酶对细胞内核酸酶比较敏感，这在体内应用时必须解决。所以反义技术要真正应用于临床，还有很多工作要做。
问题与展望
HPV相关宫颈癌的生物治疗已出现一些好的苗头，但仍有问题需要解决。一是安全问题，包括临床副作用及环境的安全性。二是将小鼠模型所得到的实验结果外推至人体必须十分谨慎，必须要有足够的实验证据和相关的动物模型支持。三是要考虑到HPV的突变株问题，因为已经检出了HPV16的突变株，它很容易逃避由原来的HPV16抗原诱发的免疫监视。四是基因的导入必须要合适的载体和启动子，这些都是开发疫苗或进行基因治疗所要考虑的。
用肿瘤特异性抗原开发的治疗性疫苗已试用于临床，但其可靠性及安全性问题仍未得到彻底解决，而且它还要依赖于载体技术及基因转移技术的进一步完善。一旦这方面有所突破，反义技术特别是核酶技术将会发挥出它巨大的抗肿瘤潜力。有实验证实，免疫佐剂和免疫刺激载体（ISCAR）的应用可确保诱导出CTL[18]。Greenstone[9]在研究以其病毒样颗粒（VLPs）作为预防性疫苗的过程中发现VLPs可用作一种有效的运载工具来产生细胞免疫反应。他将HVP16的结构蛋白L1/L2和非结构蛋白E7作成嵌合的VLPs（HPV16 l1/L2 HPV16 E7）。这种嵌合的VLPs能在小鼠身上诱导MHC-Ⅰ限制的细胞毒性淋巴细胞保护反应，从而保护小鼠不受肿瘤攻击。该工作不仅找到了一种有效的运载工具，而且还发展了预防性疫苗的另一种功能即治疗作用。最近日本学者用一种常用的抗病毒药物阿糖腺苷（vidarabine）联合鬼臼树脂（podophyllin）治疗HPV阳性的CIN患者，结果发现这种方法不仅使患者的细胞学和组织学损伤消退，而且81%的患者体内HPV dNA消失[20]。其机理还不甚明了，但这种治疗方法对HPV相关疾病的疗效是显而易见的，有可能用于宫颈癌的治疗。据悉，现在已经有人准备将“自杀”基因导入宫颈癌细胞以杀死肿瘤细胞，从而消除宫颈癌。
目前，宫颈癌的生物治疗已经在不同的方向表现出了诱人的潜力，希望在不远的将来能在某些技术方面有所突破，那么宫劲癌的治愈将成为可能。
参考文献
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2 Meneguzzi G et al.Virology,1991;189:62-69
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