中国免疫学杂志 2000年第3期第16卷 肿瘤免疫学
作者：童善庆 王建华 李彪如 丁健青 胡宝瑜 朱佑明 陆德源 华祖德 陆静
单位：童善庆（上海第二医科大学微生物学教研室，上海 200025）；王建华（上海第二医科大学分子生物实验室，99级博士生，上海200025）；李彪如（上海第二医科大学微生物学教研室，上海 200025）；丁健青（上海第二医科大学微生物学教研室，上海 200025）；胡宝瑜（上海第二医科大学微生物学教研室，上海 200025）
关键词：肿瘤浸润淋巴细胞；细胞因子；卵巢癌；细胞表型
摘 要 目的： 研究卵巢癌浸润淋巴细胞（TIL）在体外扩增后生物学特性，评估TIL用于晚期卵巢癌治疗的前景。方法： 利用流式细胞仪分析TIL的细胞表型，使用分子生物学和免疫学方法研究TIL分泌细胞因子的能力和杀伤肿瘤细胞的活性。结果： TIL细胞表型的差异可能与肿瘤的种类、性质、取材部位有关，结缔组织、基质中来源的TIL以CD3＋CD4＋为主，肿瘤组织和小血管周围以CD3＋CD8＋为主,体外IL-2的浓度对TIL的免疫学特性有很大的影响。经rIL-2扩增后，TIL分泌产生IL-2、TNF-α、IFN-γ等多种细胞因子能力及杀伤肿瘤细胞的活性均有明显提高。再加入抗CD3单抗或PHA( 合适浓度)，TIL细胞因子表达可进一步增强。TIL联合磷酰胺或IL-2治疗晚期卵巢癌患者，可显著改善患者外周血细胞表型，具有一定的疗效。结论： TIL在体外经rIL-2扩增后，免疫活性有明显提高。体内肿瘤细胞的消退可能主要并不是通过输入的TIL直接杀伤肿瘤细胞，而是在很大程度上依靠其分泌多种细胞因子增强了机体细胞免疫活性和免疫调节能力。TIL辅助其它疗法可成为晚期卵巢癌患者的一种有效治疗手段。
中国图书分类号 R737.31
Study on biological character of tumor-infiltrating lymphocytes in ovarian carcinoma
TONG Shan-Qing WANG Jian-Hua LI Biao-Ru et al
（Department of Microbiology, Shanghai Second Medical University ,Shanghai 200025）
Abstract：Objective：To study biological character of tumor-infiltrating lymphocytes on post in vitro expansion in ovarian carcinoma , and evaluate prospects of using TIL treatment of advanced stage of ovarian carcinoma .Methods：Cellular phenotype changes in TIL were analyzed by flow cytometry . By means of molecular biology and immunologic methods, ability of secrete cytokines and activities of anti-tumor in TIL were studied.Results：Difference of cellular phenotype in TIL is probably related to type,feature,and resource of tumor. CD3＋CD4+ is dominant in TIL from connective tissue and parenchyma.CD3＋CD8+ is dominant in TIL from tumor tissue and around microvessels . Concentration of rIL-2 in vitro plays a significant role in immunologic character of TIL. By means of rIL-2 expansion in vitro ,TIL has apparently been improved in competence of secreting some cytokines ,such as IL-2、TNF-α、IFN-γ,and anti-tumor activities.TIL was more stimulated by adding anti-CD3 or PHA (suitable concentration), which significantly increased its ability to secreting cytokines. Treatment with TIL+CTX or TIL+ rIL-2, could apparently improve phenotype in peripheral blood cell patients , with somewhat effects.Conclusion：Immunologic activity of TIL in vitro are apparently improved by rIL-2 expansion. Tumor regression , by means of infusion TIL, is not largely attributed to direct cytotoxicity to tumor cell , but indirectly and partly augmenting cellular activities and abilities of immunomodulation in patients with ovarian carcinoma ,through secreting multiply cytokines.
Key words：Tumor-infiltrating lymphocytes Cytokine Ovarian carcinoma Cellular phenotype
肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是直接从患者肿瘤组织中分离,在体外经IL-2激活与扩增后,再回输至患者体内治疗肿瘤,具有杀瘤效应明显，副作用相对较小,而对其它肿瘤细胞或正常细胞无杀伤作用，从而使得TIL的治疗成为晚期肿瘤治疗的一种有效的方法［1，2］。但近年来一些研究已发现TIL的治疗效果并不十分明显，差异较显著，这在一定程度上与人们对TIL的生物学、分子生物学等特性了解不够全面有很大关系。本文研究了卵巢癌TIL在体外经IL-2扩增后的生物学活性、细胞表型，细胞因子基因表达与分泌，评估TIL用于晚期卵巢癌治疗的疗效，以期较全面地了解卵巢癌患者的免疫效应细胞的功能状态，探讨TIL在体内杀伤肿瘤细胞的机制，旨在进一步发挥TIL抗肿瘤潜能及寻求更加有效的TIL 过继免疫治疗晚期卵巢癌新途径。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本来源 上海瑞金医院、仁济医院、第九人民医院妇产科提供的15例卵巢癌活检标本，其中11例为原发上皮性，2例为继发性，2例为浆液性,病理诊断明确。标准 Raji 、L929 、CTLL2细胞株,本室保存,按常规方法培养。
1.1.2 主要试剂 CD3、CD4、CD8单克隆抗体，异硫氰酸胍, 随机引物,Taq DNA聚合酶,均为华美公司。dNTP、DEPC水、PHA、CTX和胶原酶为SIGMA公司产品。 M-MLVL逆转酶：BRL公司产品。 RNA酶抑制剂为Boehringer公司产品。3H-dTR为中科院植生所产品。96孔细胞培养板为Costar公司产品。 rIL-2 标准品为 中科院上海生化所产品。 TNF标准品为 二军大微生物教研室赠。 IFN-γ标准品,IL-6标准品,rIL-2为二军大分子遗传所产品。1640 完全培养基（CM）为Gibco 公司产品。
1.1.3 PCR引物 β-act、β-act1 、IL-2、IL-2R(p55)、IL-2R(P75)、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6的扩增片段分别为660、310、458、 310、371、701、468、371、408 bp ,均为上海SANGER公司产品,引物序列,详见参考文献［2］。
1.2 方法
1.2.1 TIL 细胞分离培养 见参考文献［1，2］ 。
1.2.2 TIL 细胞表型分析 取对数生长期，存活率为95％TIL细胞，在CM中静置过夜（37％，5％CO2），使表面成分重新显露，培养的细胞每周收集1次，标记过程详见文献［3］。24 h后流式细胞仪检测。
1.2.3 TIL细胞毒效应检测 MTT方法，详细过程见参考文献［4］。放射线强度确定由β-计数仪计数，特异杀伤活性由下列公式决定：
1.2.4 TIL培养液中IL-2活性的检测 用IL-2依赖株CTLL增殖反应［4］。
1.2.5 细胞病变抑制法测TIL培养液中IFN-γ的活性 见文献［4］。
1.2.6 L929 细胞法检测TIL培养液中TNF的活性 见文献［5］。
1.2.7 TIL细胞因子基因表达的检测 半定量RT-PCR方法，见文献［2，6］。
1.2.8 TIL治疗设计 治疗计划采用化学敏感性测试筛选高活性TIL和高敏感性抗肿瘤药物。具体过程见参考文献［1,7,8］。
1.2.9 TIL治疗计划 第1天使用高敏感抗肿瘤药物。第2天观察抗肿瘤药物负作用。第3天到15天：点滴或局部注射TIL＞1×109 和rIL-2 5×104 U/天。第16天到25天：注射rIL-2 5×104 U/d。第25d：再次使用高敏感抗肿瘤药物。
1.2.10 统计学处理 采用χ2精确法检验。
2 结果
2.1 卵巢癌TIL不同扩增时间细胞表型分析 15例TIL标本在扩增后的第10，20，30天，分别检测其细胞表型，发现随着培养时间延长，TIL中CD3，CD4，CD8，HLA-DR所占比例逐步升高，说明TIL细胞免疫活性被逐步激活，结果见图1。
图1 卵巢癌TIL细胞表型标志的动态变化
Fig.1 Trending changes of cellular phenotypes of TIL in ovarian carcinoma
2.2 不同取材部位TIL细胞表型分析（经IL-2诱导扩增后20 d） 用于过继免疫治疗的TIL并不是均一群体，而是由混合淋巴细胞亚群组成。应用流式细胞仪，分析TIL的细胞表型特征发现来自不同部位TIL均以T细胞为主，主要有二种亚型CD3＋CD8＋和CD3＋CD4＋，其差异可能与肿瘤种类性质，取材部位有关，结缔组织和基质中来源的TIL以CD3＋CD4＋为主，肿瘤组织和小血管周围及腹水中来源TIL以CD3＋CD8＋为主。
2.3 卵巢癌 TIL的杀伤力 7例以CD4＋为主的TIL和8例以CD8＋为主的TIL对自体肿瘤细胞具有较强杀伤活性：分别为98.89%和90.21%（LU50/107细胞，E:T＝25:1）,对异体肿瘤细胞和K562细胞也具有一定的杀伤活性。TIL在培养的不同时间内杀伤力存在差异，在培养10～20 d内杀伤活性逐步增强，在20～40 d内TIL杀伤活性达到增高，在40～56 d内TIL仍可维持较高的杀伤活性。
2.4 TIL细胞培养上清液中扩增前后IL-2、IFN-γ和TNF-α活性测定 5例上清标本中在扩增前检测不到有IL-2、IFN-γ的分泌,扩增后分泌IL-2、IFN-γ的平均活性单位有明显的升高;TNF-α在扩增后其平均活性单位明显高于扩增前。
2.5 体外rIL-2对TIL细胞因子mRNA表达的影响 体外经IL-2扩增的TIL细胞表达β-actin、IL-2R(p55)、IL-2R(p75)、TNF-α、IFN-γ mRNA,但rIL-2去除后3 d,TIL无任何细胞因子mRNA的表达。体外用高浓度rIL-2(1 000～2 000 U/ml)扩增TIL细胞表达β-actin、IL-2R(p55)、IL-2R(p75)、TNF-α、IFN-γ,体外用低浓度rIL-2(100 U/ml)扩增,TIL细胞只表达β-actin、IL- 2R(p75) mRNA。结果见表1 。
表1 体外rIL-2对TIL某些细胞因子mRNA表达的影响
Tab.1 Influence of expression of mRNA of some cytokines of TIL with rIL-2 in vitro
| IL-2R | TNF-α | IFN-γ | IL-2 | ||
| P55 | P75 | ||||
| rIL-2 stimulation | 0.976 | 1.185 | 1.213 | 0.374 | 0 |
| rIL-2 post-remove 1) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| rIL-2(1 000 U/ml) | 0.925 | 0.951 | 0.931 | 0.892 | 0 |
| rIL-2(100 U/ml) 2) | 0 | 0.643 | 0 | 0 | 0 |
note ：compared with rIL-2 pro-and post-remove 1)P＜0.01； compared with rIL-2 low and high concentration 2)P＜0.012.6 加入抗-CD3单抗、PHA对TIL细胞因子mRNA表达的影响 和单纯rIL-2扩增TIL相比,抗-CD3和PHA+rIL-2扩增TIL后,分泌产生IL-2R、TNF-α、IFN-γ明显增强,而且分泌产生了IL-6、IL-2、IL-4。结果见图2。
图2 rIL-2+抗-CD3对TIL某些细胞因子mRNA表达的影响
Fig.2 Influence on expression of mRNA of some cytokines of TIL cultured with rIL-2+anti-CD3
Note:Lane 1, 4, 7, 10, 13, 16 : product of rIL-2 ;Lane 2, 5, 8, 11, 14, 17 : product of PBMC;Lane 3, 6, 9, 12, 15, 18 : product of rIL-2+anti-CD3
2.7 卵巢癌TIL临床治疗前后外周血T细胞表型分析 应用本研究TIL治疗计划，流式细胞仪检测治疗前后患者外周血T细胞表型，发现治疗后患者外周血T细胞亚型中CD3＋、CD4＋、CD8＋及NK、LAK细胞比例明显增高，T细胞免疫功能被增强，结果见表2。
表2 患者治疗前后外周血T细胞表型分析(n=8)
Tab.2 Analysis of T cell phenotypes of peripheral blood of from pro-and post-treatment(n=8)
| Groups | CD3＋ | CD4＋ | CD8＋ | NK | LAK |
| Pre-treatment | 52.5±2.1 | 27.5±1.9 | 30.8±2.5 | 11.5±3.5 | 16.12±2 |
| Post-treatment | 60.8±2.5 | 33.1±3.5 | 31.5±1.5 | 17.3±3.2 | 19.65±3 |
note:compared with pre- and post-treatment, P＜0.05
3 讨论
TIL是继LAK细胞之后过继免疫治疗的第二代抗肿瘤效应细胞。近年来，TIL已被广泛用于临床治疗晚期肿瘤患者取得了一定的临床效果，但随着研究的深入，已发现TIL生物学治疗效果差异明显，出现了许多问题。因而，进一步加强对TIL生物学，分子生物学等特性的了解显得十分有意义。
研究发现：刚分离TIL在未扩增前，免疫活性低下，这可能与卵巢癌细胞分泌表达IL-10，TGF-β等抑制性细胞因子有关［9］。扩增后第10、20、30天后激活的T细胞标志HLA-DR被进一步表达，TIL细胞并非是均一的细胞群体，而是由多种亚型构成，不同部位取材、肿瘤性质的差异对TIL群体中主要亚型有较大影响，这在一定程度上与各种TIL治疗疗效差异有关。
扩增后TIL对自体肿瘤细胞有较高的杀伤活性，特异性也较强。一般来说，TIL在扩增后第2、3周杀伤活性最高，此阶段为过继免疫治疗最佳时间，测定TIL上清液中细胞因子活性发现扩增后有高活性的TNF-α、IFN-γ、IL-2的分泌，经RT-PCR方法在转录水平方面进一步 证实有这些细胞因子基因的表达，但TNF-α mRNA可持续表达相当长时间,IL-2 mRNA表达只是一过性，IFN-γ mRNA表达有时缺乏。IL-2、IFN-γ都是迟发型超敏反应中重要的免疫调节因子，TNF-α是一种具有明显抗肿瘤效应的细胞因子，因而体内肿瘤细胞的消退可能并不是由于输入TIL发挥直接杀伤效应，而是在很大程度上其分泌的细胞因子增强了机体内细胞免疫活性和免疫调节能力。
研究也发现：激活的TIL在去除rIL-2后3～5 d,已无任何细胞因子的分泌,说明TIL的体内外激活对IL-2有很大的依赖性 。为此，我们选用不同的rIL-2浓度,来研究二者的关系,发现高浓度rIL-2(1 000～2 000 U/ml)可使TIL明显地扩增,但TIL对自身肿瘤的杀伤特异性下降,表现为非抗原特异、非MHC约束的细胞毒性。低浓度rIL-2(100 U/ml)扩增TIL,发现TIL的生长停滞,细胞因子表达极不活跃,在TIL中再加入抗-CD3和PHA(合适的浓度),发现TIL分泌产生IL-2R、TNF-α、IFN-γ明显增强,而且分泌产生了IL-6、IL-2、IL-4，说明加入抗CD3单抗或PHA等在一定程度上可以克服低浓度rIL-2培养中TIL特异性杀伤和有效增殖的不足。
TIL过继免疫治疗晚期卵巢癌患者在整个疗程（一般3个月）后，发现患者的外周血T细胞免疫功能有明显改善，说明TIL治疗有一定的效果，辅助其它疗法可作为晚期卵巢癌患者一种有效的治疗手段，有关TIL治疗疗效评估，我们正在深入研究。
基金项目：本课题系国家自然科学基金(39370706)资助
作者简介：童善庆，男，62岁，博士生导师，主要从事医学微生物学和免疫学的研究
作者单位：朱佑明（上海第二医科大学微生物学教研室，上海 200025）
陆德源（上海第二医科大学微生物学教研室，上海 200025）
华祖德（上海第二医科大学附属瑞金医院妇产科，上海 200025）
陆静（上海第二医科大学附属瑞金医院妇产科，上海 200025）
参考文献：
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